控制慢性乙型肝炎病毒感染的免疫治疗策略

 

细胞因子

 

干扰素-α治疗
干扰素是一种细胞因子，具有免疫调节、抗增殖和抗病毒的性质。干扰素-α(IFN-α)具有显著的免疫调节功能，但是抗病毒的效果不明显。IFN-α在1992年获得批准，此后进行了广泛的研究，在大多数国家中是第一个被批准用于治疗慢性HBV感染的药物。IFN-α已经显示出阻止病毒RNA前基因组包封进入核衣壳中，并能在肝细胞上增强乙型肝炎表面抗原的表达。

关于IFN-α治疗慢性HBV的多种研究证明了它的疗效。持续的应答改善患者的存活率，但是应答的发生频度很低。根据一项回顾性调查，包括有15个随机对照的研究涉及837名患者，使用IFN-α治疗16周后达到HBeAg血清转化的患者只有33％，相比对照组的12％。重要的是，IFN治疗的患者中HBsAg消失的记录有7.8％，相比对照组的1.8％。采用杂交检测法，可检测到HBV DNA消失和ALT水平正常化的患者，在治疗组中也比对照组中更为普遍(5)。然而，这些结果只有在经由选择的的患者群中才能获得，这些患者在治疗开始时都有明显的疾病活动。最近的大型研究显示应答率为20％(6)。在治疗初始期间的ALT水平和HBeAg血清转化率之间存在强相关性：治疗初始血清ALT升高至正常值上限2倍的血清转化率约为5－10％，升高2－5倍的转化率约20％，5倍以上的转化率约为30－40％。

干扰素治疗HBV最佳的持续时间尚未确定。在一项大型的多中心试验中证实，患者在治疗16周后没有清除HBeAg，但是此时HBV DNA水平低（<10pg/mL），继续治疗至32周是有益的。IFN-α治疗的持久反应性和继续治疗的好处，最近在几个长期的跟踪调查中进行了评估。在北美和欧洲进行的研究报道：在5－10年的跟踪调查期间95-100％的应答者保持HBeAg阴性，最终30－86％的应答者HBsAg消失。相反，亚洲的调查显示持久的应答率较低，在对照组和治疗组的患者之间没有显著的差异(7)。

最近，聚乙二醇化的IFN-α（Peg-IFN）通过聚乙二醇处理后得到改进，通过将聚乙二醇（PEG）聚合物分子粘附到IFN-α分子上生产出的药物延长了半衰期(8)。在慢性丙型肝炎感染的治疗中，显示出比传统的IFN-α疗效有较大的改善，在此基础上采用Peg-IFNα-2a治疗HBeAg阳性的患者6个月，在跟踪观察24周后，初步的结果显示，与接受传统的IFN治疗的患者相比，同时达到病毒学和生化应答的患者，Peg-IFN是传统IFN的两倍，分别为24％比12％(9)。在一项大型多中心，双盲对照的试验中，Peg-IFN单独治疗52周，跟踪观察26周后，在36％的患者中诱发HBeAg的消失(10)。这些结果显示在HBeAg阳性的CHB患者中，Peg-IFN与传统的IFN的疗效至少是相等的，但更可能要优于传统的IFN。

另外在这个多中心试验中，还研究了联合Peg-IFNα-2b和核苷类似物拉米夫定治疗是否更为有效。联合使用Peg-IFNα-2b和拉米夫定，与采用Peg-IFNα-2b单独治疗相比，在治疗结束后前者有较高的HBeAg血清转化率，但是在跟踪观察期结束时应答率是相等的。一项大型的研究（n＝537）关于Peg-IFNα-2a联合拉米夫定治疗HBeAg阴性的患者，与单独的拉米夫定治疗相比，结果显示联合Peg-IFNα-2a和拉米夫定，并没有改善Peg-IFNα-2a单独治疗的应答率。在跟踪观察24周末，在Peg-IFNα-2a治疗组中达到病毒学应答的患者与联合治疗组的患者相比为，43％：44％(11)。

 

白细胞介素－2

很多年前就已经知道白细胞介素－2（IL-2）是一种T细胞生长促进因子。在初步研究中已经证明，在慢性乙型肝炎中IL-2增强CD4+T细胞和NK细胞的功能。尽管在HIV感染的患者中接受重组IL-2治疗后，HBsAg被清除并出现抗-HBs的抗体，但是一项探索性实验中采用天然的IL-2治疗慢性HBV的患者，没有出现生化或是免疫应答。一项随机对照的试验比较IL-2和安慰剂治疗HBV和HIV同时感染的患者，显示CD4+T细胞的数量明显的增加，但是IL-2治疗没有改变HBV的复制状态(12)。

   在一项双盲随机对照的试验中，31名慢性HBV感染的患者接受不同剂量的IL-2皮下注射。在治疗组和安慰剂组中，观察到HBeAg的消失率没有差异性，在两组中血清HBV DNA浓度的下降也是相似的。还进行了调查IL-2联合其他抗病毒治疗的研究。一项随机对照的试验显示，在HBV DNA降低，HBeAg血清转化或ALT正常化方面，联合IL-2和IFN-α治疗没有叠加的效果。乙型肝炎表面抗原疫苗，与单独的拉米夫定，或是拉米夫定加IL-2联用，没有显示出对IL-2的有任何的叠加治疗效果(13)。

白细胞介素－12

白细胞介素12（下称IL-12）是在免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子。能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导IFN-γ的分泌，调节Th1/Th2细胞发育，促使其向Th1细胞分化，IL-12是诱生CTL免疫应答的最佳细胞因子，启动细胞介导的免疫反应。它本身是一个强烈的前炎症因子，并能诱导其他前炎症因子的分泌。不但能活化先天性免疫细胞，促进APC功能，特别是促进树突状细胞成熟，提高抗原提呈的效率，还可作为第3信号直接活化初始T细胞，使其转变为效应性T细胞。另外IL-12协同IL-18促进记忆性T细胞的激活作用，使其能迅速消除被感染的细胞，同时促进其他细胞因子的分泌，抑制病毒复制，调节其他细胞免疫功能。

一．IL-12的基因与分子结构，产生的调节及其生物学效应。

IL-12的主要产生者是对微生物的刺激应答的单核/巨噬细胞，抗原提呈细胞、B细胞和嗜中性粒细胞及角质细胞。于1989年首次被发现后经纯化当时称作自然杀伤细胞刺激因子（NKSF）或细胞毒性淋巴细胞成熟因子（CLMF）。1991年Gubler等将CLMF的cDNA克隆并表达成功，表明是一种新的细胞因子。并将其命名为IL-12。

IL-12是由35kd的轻链（p35，IL-12α）和40kd的重链（p40，IL-12β）组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5～pH5.5。IL-12的生物学活性具有专一性，必须由高亲合力的受体IL-12R来介导。IL-12R存在于激活的T细胞以及静止或激活的NK细胞上，B细胞和静息的T细胞不表达IL-12R。

二. IL-12的生物学效应

1．调节Th1/Th2应答，使其向Th1倾斜，诱导Th1细胞发育和增殖，增强T细胞的杀伤功能。

2．活化NK细胞产生细胞毒作用，增强NK/LAK细胞溶解活性，促进NK细胞的增殖。
IL-12能激活NK细胞使之成为具有溶解靶细胞功能的杀伤细胞，其杀伤靶细胞和清除病原微生物通过两个途径，一是溶细胞性，即依赖穿孔素、颗粒酶和Fas配体，另外是非溶细胞性，即通过IFN-γ、TNF-α和IL-1等细胞因子的产生。

3．IL-12诱生T细胞、NK细胞产生IFN-γ
IL-12诱生活化的T细胞产生IFN-γ, IL-12的这种诱生作用的特点是在较低的浓度即可发生作用，IL-2、TCR-CD3复合体、活化的CD28配体均能与IL-12产生协同作用。

4．IL-12的网络性
IL-12是免疫网络中的核心细胞因子，架起了先天性免疫和后天获得性免疫之间的桥梁。IL-12诱导Th0分化为Th1促进其发育和增殖，IL-12与亚适剂量IL-2协同诱导T细胞增殖，增强CTL细胞毒活性，促进T细胞和NK细胞产生IFN-γ、TNF-β。这种协同作用是通过IL-2R的表达实现的，IL-12可诱导IL-2R的高水平表达，IL-2可诱导IL-12R的表达增强。这种相互上调对方受体的结果增强了这二个细胞因子的活性。

三. rhIL-12治疗慢性乙型肝炎的临床应用前景
IL-12于1989年首次被发现并纯化，其基因和分子结构已确定，因此有可能采用基因工程的方法生产rhIL-12。国外已有多个药厂生产rhIL-12供正在进行的多项Ⅰ/Ⅱ期临床试验使用。目前临床的Ⅰ/Ⅱ期试验主要用于治疗进展期肿瘤和实体瘤如恶性黑色素瘤，非何杰金氏淋巴瘤，肾细胞癌等。病毒方面主要用于艾滋病，慢性乙型、丙型肝炎，此外还有用于治疗移植物抗宿主病（GVDH）和治疗过敏性哮喘的报告。晚近在美国应用rhIL-12于临床的科研课题，包括正在招募志愿者或进行Ⅰ/Ⅱ期临床观察的约有16项。国内应用rhIL-12进行治疗肿瘤的多项停留在实验研究阶段。

（一） 可能由于北美州和欧洲慢性乙型肝炎的发病率较低，以致rhIL-12用于治疗慢性乙型肝炎的报告很少。截至2005年11月仅见到2篇报告。

1．Carreno和Zeuzem等于2000年报告应用rhIL-12治疗46例慢性乙型肝炎Ⅰ/Ⅱ期临床观察结果。作者观察了三种不同剂量rhIL-12的治疗效果、药效学、药代动力学、耐受性及毒副作用。

2．rhIL-12与拉米夫定联合应用治疗e抗原阳性慢性乙型肝炎。

Rigopoulou等于2005年底报告15例rhIL-12联合拉米夫定的治疗效果，主要观察rhIL-12与拉米夫定联合使用是否较单独应用拉米夫定为好。作者认为通过详细的免疫学观察认为rhIL-12可以激活T细胞对HBV的应答，增加病毒特异性CD4+T细胞的频率，促进IFN-γ的产生。拉米夫定与rhIL-12联合应用显示剂量依赖性的抗病毒活性，但rhIL-12应用于HBeAg阳性的慢性乙肝患者不能使其避免HBV的复制。
上述的两个报告提示rhIL-12可以介导细胞免疫应答，特别是诱生IFN-γ的分泌，抑制HBV复制，甚至清除HBV。但应指出IL-12体内产生的生物学效应与做为药物的rhIL-12应用于治疗疾病，二者在诸多方面都存在着差异和变数。我们认为单独使用rhIL-12治疗慢性乙型肝炎有一定的局限性。Rigopoulou应用rhIL-12和拉米夫定联合治疗HBeAg阳性慢性肝炎的患者，其中部分病例转氨酶水平较低有可能是属于免疫耐受期患者。显而易见单独使用rhIL-12治疗这类患者效果很难令人满意。
（二） rhIL-12作为治疗性乙肝疫苗的佐剂可能具有良好的前景。

IL-12本身是一个强烈的前炎细胞因子并诱生其他前炎细胞因子的分泌。不但能活化先天免疫细胞，促进APC功能，特别是DCs细胞成熟、活化，提高其抗原提呈效率。值得提出的是IL-12作为第3信号可直接活化初始T细胞使其转变为效应性T细胞。另外，IL-12对免疫记忆T细胞（包括CD4+和CD8+T细胞）也具有活化作用，能迅速杀灭或消除被感染的细胞，同时促进其他细胞因子的分泌，抑制病毒复制并调节其他细胞免疫功能。可见IL-12作为治疗性乙肝疫苗有其理论基础。

一些试验已证明用某些基因或其他细胞因子特别是IL-12作为佐剂与乙肝病毒疫苗共刺激，可改善抗原的微环境，明显提高疫苗的抗原性和特异性的免疫应答。IL-12本身是一个抗HBV的细胞因子，作为佐剂可以明显上调机体对HBsAg或HBV DNA的免疫应答，促使Th1细胞发育和特异性CTL的细胞毒活性，诱生IFN的分泌。

 

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
重组的人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）是树突状细胞（DC）成活，分化和功能的主要刺激细胞因子。它增加T细胞协同刺激分子的表达，并增加MHC Ⅱ类分子的表达，这对于CD4+T细胞的抗原识别和启动免疫反应至关重要。rhGM-CSF免疫调节活性的结果是，在亚最佳抗原浓度下增强T细胞的增殖反应，并在体内和体外扩增初期的抗体反应。

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