李继强 陆伦根 华静 吴亚云 曾民德
上海第二医科大学附属仁济医院上海市消化疾病研究所,上海(200001)
*本研究为国家自然科学基金资助项目（No.39670339）
苦参碱是中药苦参提取的有效成分，含有多种生物碱及黄酮类物质，具有抗炎及抑制某些细胞因子的产生的作用。本实验分离培养大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)，观察苦参碱的一种单体成分氧化苦参碱对HSC增殖的影响，为肝纤维化的治疗提供新的可能途径。
材料和方法
1.实验动物 Wistar雄性大鼠10只,体重400～450g, 购自中国科学院上海实验动物中心.普通饲料喂养,自由进食.
2.药物 氧化苦参碱为上海生物化学制药厂产品（批号961044).
3.实验试剂及仪器 Nycodenz为美国Sigma产品,Pronase E 为德国Merck产品,DMEM培养基为GIBCO公司产品,胶原酶粗制品为上海医药工业研究院产品,MTT为上海华顺公司提供. CO2培养箱为Flow Laboratories公司产品,倒置和荧光显微镜为Olympus公司产品,离心机和酶标仪(E-Liza Mat-3000)为Beckman产品.
4. 实验方法
4.1. HSC的分离 大鼠经1.5%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,门静脉插管输入无Ca2+灌注液,同时剪断下腔静脉放血,灌注30min后,小心分离肝脏,待肝组织软化后，剪碎,酶消化振荡30min过200目网后,滤液离心450g 7min,弃上清,沉淀物以1:2的体积与18%(W/V)的Nycodenz混匀,上覆少许DMEM培养液,行密度梯度离心,1450g,17min, 离心后取界面处细胞,用DMEM清洗1次,450g 7min, 取沉淀细胞悬浮于含20%小牛血清的DMEM中.台盼蓝染色判断存活率并计算产率.
4.2.HSC培养 细胞以每平方厘米1X105接种于培养皿(Coring),置5%CO2,95%空气培养箱中370C,24hr细胞贴壁后换液,以后隔3-4天更换1次培养液.
4.3.HSC鉴定 新分离的的HSC悬液点涂片,置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下,细胞呈现蓝绿色自发荧光.兔抗人Desmin爬片作SP免疫组化染色示胞浆阳染者为HSC.
4.4.MTT比色法 原代培养的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％DMEM培养液中，调整细胞数为1x108个/l，以每孔100ul加入96孔Nunc培养板内。置37C，5％CO2培养箱内预培养72h后，分为8组,一组为空白对照组,其余7组加入不同浓度(分别为0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8和16ug/ml)的氧化苦参碱，每组设6个复孔。48h后，每孔加入5mg/ml的MTT液20ul，振荡后370C，5％CO2继续孵育4h后，用酶标仪（E－Liza Mat-3000)双波长测定其OD值，以OD值间接反映HSC在培养孔中的增殖密度(OD值越低则说明HSC的增殖越弱)。测定波长为570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示OD值为OD570减去OD630，以消除非特异性光吸收效应。
5.统计学方法 用Student t检验,以P值<0.05判断有显著性差异.
结 果
1 HSC细胞的得率和纯度 用本法分离的HSC，其得率每肝为5x106-1x107，以0.4%台盼兰染色，细胞纯活率在98％以上。原代培养的HSC Desmin阳性在90％以上，传代培养后HSC Desmin阳性在98％以上。
2 氧化苦参碱对大鼠HSC增殖的影响 见附表. 氧化苦参碱浓度30.5ug/ml之培养孔液OD值均低于0.25ug/ml孔，与正常对照组相比统计学有非常显著意义（P<0.01).
附表 不同浓度的氧化苦参碱对大鼠HSC增殖的影响
组别 氧化苦参碱浓度 (ug/ml) 培养孔液OD值 X±S
I 16 0.0905±0.0081**
II 8 0.1097±0.0199**
III 4 0.1097±0.0310**
IV 2 0.1307±0.0247**
V 1 0.1437±0.0326**
VI 0.5 0.1307±0.0214**
VII 0.25 0.1677±0.0465
正常对照 0 0.2033±0.0313
注：与正常对照组比较：**P<0.01
讨 论
氧化苦参碱治疗有可能影响慢性丙型肝炎患者肝纤维化进程，但对其机理缺乏了解。由于肝纤维化是肝脏细胞外基质（ECM〕异常生成和积累的结果，肝细胞、Kuffer细胞、内皮细胞等均参与肝纤维化形成，但以HSC作用最重要，后者的激活增殖是各种原因引起肝纤维化形成的中心环节。而对HSC增殖的抑制是其防治的策略之一。苦参是常用的清热燥湿中药，体外实验证明，其具有抗病毒作用，还有免疫调节功能，对肝Kupffer细胞分泌 白介素－1，白介素－6和肿瘤坏死因子－a有明显的抑制作用。苦参碱尚有类似糖皮质激素样的直接抗炎作用，能稳定细胞膜。四氯化碳诱导的大鼠实验性肝纤维化用苦参碱治疗后能降低大鼠血清ALT、HA及肝组织中HYP含量。病理结果显示能明显减轻肝细胞变性坏死及结缔组织的生成。本体外实验观察到氧化苦参碱对培养的大鼠肝HSC 增值有明显的抑制作用，其浓度范围在0.5～16ug/ml之间，因此有根据推测氧化苦参碱减缓肝纤维化形成与其抑制肝内星状细胞的增殖有关。这种抑制作用是如何发生的还有待进一步研究。
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