喻长远 ，李家邦 ，郭振球
(1．中南大学湘雅医院，湖南长沙；2．湖南中医学院，湖南长沙)
摘要：目的：观察肝纤宁对肝细胞生存的影响。方法：用CCL4肝纤维化模型大鼠肝细胞．观
察肝纤宁培养对其生长的作用。结果：肝纤宁能提高肝细胞存活率，降低肝细胞培养上清液转氨酶(ALT)，升高糖原(PAS)及酸性磷酸酶(ACP)含量，电镜观察肝纤宁组线粒体肿胀少而轻，滑面内质网增生，扩张不明显，损伤性细胞结构少。结论：肝纤宁能提高肝细胞存活率，促使肝细胞修复再生，从而发挥抗肝纤维化作用。
肝纤宁颗粒系根据《伤寒杂病论》防己黄芪汤和鳖甲煎丸化裁组方，用于慢性肝炎肝纤维化。肝纤维化的形成与肝细胞坏死密切相关。本实验观察肝纤宁对肝细胞存活率的影响，以验证其抗肝纤维化作用。
实验材料
1 动物
SD大自鼠，雌雄各半，体重180g～220g，购自上海市西普尔一必凯实验动物有限公司，合格证号：N.0001750。
2 药物
肝纤宁颗粒，长涉九芝堂药业集团公司提供，批号：951019，分别配成43 2％ 、21．6％ 、10．8％ 3个浓度备用。大黄麈虫丸：广东阳江制药厂生产．批号：930321，配成10 8％。胰蛋白酶：Difco进口分装，上海化学试剂站分装厂，批号：940511 秋水仙碱：购自北京华美主物工程有限公司，批号：930514，配成0 001％药液。CCL4：为淮南化学试剂总厂生产，批号：950402。
3 仪器
日立H600透射电镜，由湖南医科大学电镜室。
方法与结果
1 CCL4模型制作。
大鼠(正常组除外)皮下注射50％CCL4蓖麻油，0．3ml／100g鼠重，1次/d．共12次。第1 3天后继续用50％CCL4蓖麻浊皮下注射，0．3ml／100g鼠重，2次／周，共8次。喂高脂饲料(84％ 玉米粉+15．5％猪油+0 5％胆固醇)和30％乙醇。
2 肝细胞的分离及培养
大鼠断头处死，剪开腹部取肝脏，75％ 乙醇浸透，剪成1×2mm2植块，0．25％胰蛋自醇消化10min～ 15min，Hank’s液洗3次，用0．2％ 苔酚蓝染色，计数细胞，使肝实质细胞数选90％ 以上，细胞存活率95％ ，调细胞浓度2 x 106／ml，加PRMI一1640(含青、链霉素各100u／ml，小牛血清10％)培养液，接种于20mL培养瓶中，每瓶5mL，37℃ ．5％CO2 条件培养。
3 动物分组
随机分成7组(正常组．模型组，肝纤宁大、中、小剂量组．秋水仙碱组．大黄麈虫丸组)，每组设1O个平行管。
4 检测项目及方法
将肝细胞培养24b、30h后，计数各组细胞存活率，取上清寝测转氨酶(ALT)；培养30h后用胰蛋自酶消化，取1 xl03肝细胞液0.1mL，水平涂片做糖原(PAS)及酸性磷酸酶(ACP)染色。剩余肝细胞液加甲醛缓冲液固定2b后弃上清．0．25％ 戊二醛固定24h，1％ 锇酸固定1h，常规脱水包埋，切片染色．做电镜观察。
5 统计方法
各组问细胞存活盎比较用h检验，ALT比较用t检验，各组问PAS、ACP比较用多组和两组Ridit均值检验。
结 果
1 存活率比较
从表1（略）可以看出，模型组和各给药组存活率均较正常组为低(P<0．05)，肝纤宁细胞存活率较模型组高，差异有显著性意义(h检验，P<0．O1)。
2 细胞培养上清液中转氨酶(AI_T)测定结果(见表2)
肝细胞培养上清液中的ALT，各组均比正常组高(P<0．O1)，与模型组比较，肝纤宁组、被水仙碱组、大黄麈虫丸组ALT 均明显降低(P<0.01)。
3 肝细胞中糖原(PAS)及酸性磷酸酶(ACP)测定结果
常规PAS、ACP染色后，于高倍镜下观察，每张玻片计数100个肝细胞。PAS、ACP含量评定标准：(0)未见颗粒；(+)少正颗粒；(++)颗粒较多；(+++)满布颗粒且有少量结块；(++++)大量结块。
从表3、4（略）可知，模型组PAS、ACP含量均明显低于正常组(P<0．01)，肝纤宁组、大黄麈虫丸组PAS、ACP含量均显高于模型组(Ridlt检验，P<0．O1)，而秋水仙碱组PAS、ACP含量与模型组相当(P<0．05)。
4 电镜观察结果
正常组：散在肝细胞多呈圆形、椭圆形，细胞核为卵圆形。细胞结构完整，线粒体体积正常，嵴、基质中有少量致密颗粒，高尔基体发育好，溶酶体少，内质网发育正常，池来扩张。大部分细胞相互密切接触，形成细胞连接，出现膜特化结构和毛细胆营。模型组：肝细胞膜部分已破裂，聚台成团形，细胞核变形，表面不规则。细胞结构异常，染色质聚集成团，胞质电子密度降低，线粒体肿胀，由质网扩张，池内容物电子密度低。细胞连接少，已形成细胞连接处，可见局部分离，未见膜特化及毛细胆营结构。肝纤宁中剂量组：肝细胞膜完整，细胞核为卵圆形，部分肝细胞中线粒体肿胀，电子密度偏低，嵴模糊不清；内质网增生，部分池扩大，内充满电子密度偏低的均质物；细胞多连接成团，相邻肝细胞可见保存良好的膜特化部分和毛细胆管结构。
讨 论
肝纤雏化的形成与细胞-细胞固子-细胞外问质之间一系列复杂的反应有关。肝纤维化形成最直接的原目是肝细胞坏死，目为坏死本身即是一种强有力的刺激和诲导因素，炎症致肝细胞损伤，使肝纤维化的启动因素。正常肝细胞不参与胶原合成，在功能发生改变，如肝纤维化、肝痛时，肝细胞可合成大量胶原。CCL4起肝脏中毒损伤，并在肝细胞内代谢产生自由基氧化生物膜脂质，从而破坏细胞质膜及膜性细胞器(线粒体、微粒体)结构的完整性，扰乱细胞生理代谢活动。ALT是细胞受损、膜通透性增加比较敏感的指标，ACP是细胞内溶酶体标志酶 ，溶酶体内含有多种水解酶，是细胞内一个极为精细的消化系统，它对外源性有害物质和细胞内破损衰老的细胞器均有分解消化作用。ACP活性反映溶酶体功能状态．通过细胞化学染色，发现肝纤宁组PAS、ACP含量均高于模型组．说明肝纤宁对抗CCL4毒性作用，与其促进糖原代谢，阻止细胞膜脂质过氧化，增加ACP活性，促进细胞再生修复功能有关。电镜中可见模型组线粒体肿胀，内质网扩张明显，而肝纤宁组线粒体肿胀少而轻，滑面内质网增生、扩张不明显，损伤性细胞结构少。滑面内质网主要功能是参与解毒，肝纤宁对CCL4中毒损伤肝纤维化模型大鼠的肝细胞进行培养，发现肝纤宁可明显提高细胞存活率(P<0 01)。电镜结果显示，模型组肝细胞膜部分破裂，己形成的细胞连接处可见部分分离．未见膜特化结构。而肝纤宁组可见肝细胞膜完整，细胞多连接成团，相邻肝细胞内可见保存良好的膜特化部分。因此，肝纤宁抗肝细胞损伤，可能与其保持肝细胞膜的稳定有关。
肝纤宁由黄芪、元胡、鳖甲、莪术、茯苓等药组成，具有舒肝活血、健牌祛湿作用。车实验研究表明．肝纤宁可促进物质代谢，增强细胞解毒功能，促使肝细胞修复再生，间接抑制胶原纤维合成，从而发挥抗肝纤维化作用。
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