肝脏的免疫与乙肝抗病毒治疗----百济新特药房肝病专科

一、肝脏免疫细胞的组成和特点

　　肝脏内的免疫系统包括天然免疫和特异性免疫两个组成部分，其在HBV感染的发生、发展和转归中的作用正被逐渐认识。其中肝脏的组织结构、功能特点对肝脏的免疫功能具有重要意义。肝脏具有肝主动脉和门静脉双重血管供应。每分钟大约有人体血液总量的30%流经肝脏，每24h就携带着108个外周血淋巴细胞通过小叶间动脉或门静脉终末支进入肝实质，然后穿过肝窦状隙，通过中央静脉离开肝脏实质。窦状隙中血流不规则运动和滞留等因素加强了淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的接触，促进了淋巴细胞的渗出。同时，肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）层的窗孔也有利于淋巴细胞的渗出和迁移，有利于与细胞外基质、星形细胞和肝细胞等更多地接触。

　　肝脏细胞中有60%～80%的细胞为肝细胞，其余的非实质细胞多种多样，包括LSEC、Kupffer细胞、胆管细胞、星形细胞和肝内淋巴细胞。肝内淋巴细胞大量分布在肝实质和门静脉内。人体肝脏包含大约1010个淋巴细胞，包括天然免疫（NK，NKT淋巴细胞）和特异性免疫系统的淋巴细胞（T、B淋巴细胞）亚群，后者还包括NKT淋巴细胞和TCRγδ T淋巴细胞。

二、慢性乙型肝炎的临床免疫应答特征

　　肝脏的免疫状态影响着慢性乙型肝炎的病程和临床转归。慢性乙型肝炎患者体内发生的天然免疫和特异性免疫的损伤以及对HBV的免疫耐受，多发生在肝脏组织中，这些可能是病毒持续复制和肝脏慢性炎症的主要原因。

　　1、慢性乙型肝炎患者的天然免疫损伤：在急性HBV感染阶段，外周循环中浆样树突状细胞（pDC）的频率和其产生干扰素（IFN）α的能力大大下降，而在肝脏中则有pDC的聚集。在慢性HBV感染中，pDC和髓样树突状细胞（mDC）的表型和功能受损，外周血中mDC和pDC的细胞因子释放能力明显降低。我们最近发现，循环DC亚群的数量减低可能是DC从血液迁移到肝脏的结果。另外，在慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者体内，NK/NKT淋巴细胞亚群的功能也呈下降趋势。研究发现，HBV转基因鼠伴有NKT淋巴细胞从肝脏中消失，提示NKT淋巴细胞的激活能够抑制HBV的复制，并在发挥抗病毒作用的同时造成肝脏损伤。急性乙型肝炎患者血清中白细胞介素（IL）-2水平明显升高，而IL-2可通过激活NK细胞及CD8＋T淋巴细胞来清除病毒，然而在慢性乙型肝炎患者体内，活化的NK细胞及CD8＋T淋巴细胞表面的IL-2Rα链分离水平明显升高，这就妨碍了由IL-2诱导的免疫反应，造成肝脏内NK细胞的活化障碍。

　　2、慢性乙型肝炎患者的特异性免疫损伤：慢性HBV感染时，不同T淋巴细胞亚群的受损程度不同，往往在削弱针对病毒优势表位的T淋巴细胞反应的同时，增强对次优势表位的反应。患者体内HBV特异性T淋巴细胞反应减弱，从这些患者的外周血中分离出来的病毒特异性T淋巴细胞大部分已经失去了增殖和产生细胞因子的能力，细胞毒作用也降低，这种现象被称为T淋巴细胞功能耗竭。T淋巴细胞功能耗竭发生时，首先出现IL-2的产生减少，随后是细胞毒性和TNFα的产生降低，然后是IFNγ产生减少。病毒的持续存在和抗原长期作用是导致T淋巴细胞耗竭的原因之一。其次，辅助性CD4＋细胞的数量减少、Th2漂移、病毒变异也是CD8＋T淋巴细胞耗竭的原因。此外，慢性乙型肝炎患者的成熟mDC表达CD80、CD86降低，成熟障碍，mDC对T淋巴细胞的刺激能力降低，导致HBV特异性T淋巴细胞反应性不足。此外，T淋巴细胞功能耗竭的机制还可能与一系列抑制性的受体作用有关，例如程序性死亡受体-1（programmed death 1，PD-1），它是CD28共刺激家族中的一种抑制性受体。T淋巴细胞和B淋巴细胞等都有表达，它的配体PD-L1（B7-H1）组成性表达在肝脏中的抗原呈递细胞如DC、LSEC、Kupffer细胞和星形细胞上。PD-L1与肝浸润T淋巴细胞上的PD-1之间的相互作用导致T淋巴细胞抗病毒效应功能的抑制和细胞凋亡。在慢性乙型肝炎患者中，外周血mDC和单核细胞上PD-L1表达水平高于健康人。研究发现PD-1/PD-L1共抑制信号途径的异常升高与HBV特异性CD8＋T淋巴细胞功能耗竭有关，后者可能直接导致HBV慢性持续性感染。通常认为调节性T淋巴细胞与慢性HBV和HCV感染者的病毒特异性免疫损伤有关。

　　3、慢性乙型肝炎时增强的肝脏免疫耐受：肝脏的结构、位置、功能和特性决定了肝脏的免疫耐受是生理需要。慢性HBV感染中的肝脏免疫耐受发生可能有以下几点原因：（1）肝脏内占优势的NK、NKT淋巴细胞群具有招募外周循环中T淋巴细胞的作用，这些招募来的活化的T淋巴细胞易于发生凋亡。（2）LSEC通过捕获和杀伤活化的HBV特异性T淋巴细胞来终止免疫反应。（3）肝细胞呈递内源性抗原活化幼稚CD8＋T淋巴细胞，由于缺乏足够的共刺激信号而发生“疏忽死亡（death by neglect）”。（4）慢性乙型肝炎患者的肝脏内Treg细胞浸润增多。另外，mDC和CD4＋/CD8＋T淋巴细胞细胞间PD-1/PD-L1信号可能有增强，HBV感染后的肝脏微环境改变使mDC成熟障碍，不成熟的mDC易诱导免疫耐受。这些因素都可以进一步促进慢性乙型肝炎时肝脏免疫耐受的发生。但是肝内各因素是如何协同形成肝脏耐受，以及如何促成肝内抗HBV免疫反应的削弱，这些细胞和分子机制仍不清楚。

三、慢性乙型肝炎的肝脏免疫和抗病毒疗效的关系

　　抗病毒治疗有利于抑制HBV复制，减轻肝脏损伤和减慢疾病进展。研究显示，在抗病毒治疗的同时，肝脏本身的抗病毒免疫反应对治疗的应答起着决定性作用。比如拉米夫定在治疗早期CD4＋T淋巴细胞反应性增高，但6个月后又恢复到治疗前水平，HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞反应也不能长期维持，因而患者对抗病毒治疗应答性不佳。阿德福韦虽然可以更好地抑制HBV复制，提高慢性乙型肝炎患者的mDC数量和功能，但也不能使CD4＋T淋巴细胞功能完全恢复，抗病毒治疗仍不能产生长期、持续的病毒学反应。

　　我们研究发现，慢性乙型肝炎患者经过拉米夫定治疗后，可见到pDC细胞数量升高。可见，以pDC为主的天然免疫应答可能影响了抗病毒治疗的疗效。IFNα具有抗病毒和免疫调节的双重功效，IFNα治疗可诱导HBcAg特异性的T淋巴细胞增殖和强烈的肝内CD8＋T淋巴细胞反应，包括CD8＋和CD8＋GrB T淋巴细胞增加，以及分泌IFNγ的CD8＋T淋巴细胞增高，这些都可通过溶细胞和非溶细胞的机制抑制和清除HBV，但不能诱导CD4＋和NK/NK T淋巴细胞反应。我们最近对31例接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者进行mDC和pDC频率和功能的随访分析发现，接受重组IFNα-1b治疗的完全应答者，其循环pDC数量和CpG刺激下pDC产生的IFNα量在早期下降，然后迅速恢复，而在无应答者中无此变化。外周pDC数量的最初迅速降低可能是pDC迁移到了肝脏，在肝脏发挥非特异性抗病毒作用。以前也有关于IFN治疗能明显提高应答者肝内CD8＋T淋巴细胞数量和肝脏巨噬细胞上CD14表达的报道，所以，我们认为IFN治疗可广泛地募集外周包括pDC在内的免疫细胞到肝脏，以加强病毒清除和减少潜在的肝损伤。特别是IFN治疗2周后，完全应答者的pDC数量又增加，pDC产生的IFNα在12周左右达到峰值，同时伴随着HBV清除、HBeAg血清学转换和循环mDC数量和Th1因子水平的提高。虽然慢性乙型肝炎患者对IFN治疗的应答性仍取决于很多因素（如HBV基因型、治疗前的HBV-DNA水平和ALT水平等），但我们的研究结果提示治疗12周后pDC功能和频率的恢复可能是预测IFN治疗效果的指标之一。

　　肝脏内NKT淋巴细胞的抗病毒作用已经得到肯定。大量的NKT淋巴细胞在肝脏内即可直接发挥抗病毒作用。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）最初被用于肿瘤的免疫治疗，外周血单个核淋巴细胞在体外经IFNγ等细胞因子的诱导，NKT淋巴细胞比例显著上升，可达50%以上。我们应用CIK结合抗病毒治疗的临床研究结果表明，联合治疗可使免疫活化期患者的HBV-DNA、血清ALT等明显下降，有些患者出现了完全应答，总有效率可达60%。同时，患者外周血细胞亚群构成比发生显著变化，激活的CD8＋T淋巴细胞、CD8＋CD56NKT细胞数量和比例都大幅度提高，细胞激活标志CD25表达百分率也增加。不过HBV特异性Pentamer阳性细胞频率没有变化，说明CIK细胞的抗病毒效应主要来源于非特异性的CD8＋T淋巴细胞和NK/NKT淋巴细胞。CIK免疫细胞治疗作为一种天然免疫治疗策略，与抗病毒治疗的联合应用，可提高抗病毒治疗的应答率。但目前仍需进一步扩大病例数，以便全面评价其疗效。

四、展望

　　慢性乙型肝炎患者体内存在着天然免疫和特异性免疫的损伤，同时肝脏本身存在增强的免疫耐受，后者是一把双刃剑，一方面减轻肝脏的病理损伤，另一方面有利于病毒的持续复制，不利于抗病毒治疗。所以，为了提高临床疗效，对慢性乙型肝炎不仅要进行抗病毒治疗，而且应考虑联合开展抗病毒免疫治疗，调整肝脏免疫耐受状态，增强抗病毒免疫应答，同时避免发生肝脏的免疫损害，因此发展新型免疫调节治疗的策略和具体措施十分重要。需要研究和确定介导病毒清除的免疫细胞的最佳数量、表型和效应功能，并建立免疫清除病毒的最优治疗方案。此外，利用Treg对病毒特异性T淋巴细胞的抑制作用对HBV感染的免疫反应进行治疗性调节也是一种具有应用前景的治疗方法。

　　随着对肝脏免疫和HBV感染的基础和临床研究的深入，抗HBV免疫应答与肝脏病理损伤领域将有很多问题需要阐明。由于开展临床研究不易得到肝组织标本，所以很难系统全面地研究人体肝脏内部的抗HBV免疫反应。因此，有必要建立合适的动物模型（比如人-鼠免疫细胞嵌合的小鼠模型）。相信随着慢性乙型肝炎患者体内的天然免疫和特异性免疫功能损伤机制研究的深入，对肝脏耐受相关机制的阐明，将有助于发展更新更好的免疫学治疗方法，与抗病毒药物的联合应用将提高慢性乙型肝炎的临床疗效。