[摘要]
甘草酸二铵为甘草提取制剂，具有较强的保护肝细胞膜及改善肝功能的作用，我们拟用体外培养的HepG2细胞作为模型，观察甘草酸二铵对内毒素（LPS）致肝细胞凋亡的拮抗作用。
1．材料与方法：细胞系为HepG2细胞系高度分化的人肝癌细胞株，生物学特性与正常肝细胞相近；甘草酸二铵由中国连云港正大天晴制药有限公司提供；内毒素(LPS)为美国Sigma公司产品；RPMI 1640培养基（干粉）为美国Hyclon公司产品。实验分3组，正常对照组为普通培养的HepG2细胞；凋亡模型组为20μg/ml LPS作用24h的HepG2细胞；甘草酸二铵保护组分3个时段组：保护Ⅰ组为LPS与1mg/ml甘草酸二铵同时加入培养液，培养24h的HepG2细胞；保护Ⅱ组为LPS作用8h后，加入甘草酸二铵继续培养24h的HepG2细胞；保护Ⅲ组为LPS作用16h后，加入甘草酸二铵继续培养24h的HepG2细胞。观察指标包括：(1)四唑盐(MTT)比色法检测各组细胞活力；(2)细胞培养上清液中白蛋白（ALB）与乳酸脱氢酶（LDH）含量检测；(3)DNA琼脂糖凝胶电泳（DNA Ladder）法检测细胞凋亡情况；(4)流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡；（5)统计学分析采用计量资料的t检验。
2．结果：（1)细胞凋亡片段化DNA检测结果：正常对照组和LPS单独作用8h以及LPS分别作用8h、16h后加入甘草酸二铵实验组，均未见片段化DNA梯形条带；LPS单独作用16h、24h以及LPS和甘草酸二铵同时加入共作用实验组，出现片段化DNA梯形条带。（2）细胞周期和细胞凋亡检测结果：正常对照组和LPS单独作用8h以及LPS分别作用8h、16h后加入甘草酸二铵实验组，均未见凋亡峰；LPS单独作用16h、24h以及LPS和甘草酸二铵同时加入共作用实验组，均出现凋亡峰，凋亡率分别为2.45%、4.38%和2.00%。（3）各组细胞活力：凋亡模型组与正常对照组比较，细胞活力明显降低，差异有显著意义（t＝31.70，P<0.01）；甘草酸二铵保护Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组与凋亡模型组比较，细胞活力显著高于凋亡模型组，差异有显著意义（t值分别为4.25、24.88、17.58， P值均<0.01）；说明甘草酸二铵对LPS致肝细胞凋亡有一定的保护作用。（4)细胞培养上清液中白蛋白与乳酸脱氢酶含量测定：凋亡模型组与正常对照组比较，白蛋白含量明显降低，由（1.743±0.062）g/L下降到（1.182±0.046）g/L，t＝12.61，P<0.01；甘草酸二铵保护组（保护Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组）与凋亡模型组比较，白蛋白含量明显高于凋亡模型组，（1.326±0.036）g/L、（1.602±0.033）g/L、（1.323±0.066）g/L对（1.182±0.046）g/L，t值分别为4.26、12.75、3.05，P值均<0.05，说明甘草酸二铵对LPS致肝细胞凋亡有一定的保护作用。而几组乳酸脱氢酶含量比较无明显差异，提示LPS引起部分肝细胞凋亡没有导致乳酸脱氢酶的升高。
3. 讨论：目前研究表明，内毒素可以通过激活单核/巨噬细胞系统释放肿瘤坏死因子α等细胞因子作用于肝细胞而参与凋亡过程，也能够诱导肝细胞表达Fas/FasL启动细胞内凋亡信号通路致肝细胞损伤[1-3]。甘草酸二铵系第三代甘草提取物，具有较强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用，目前临床上广泛用于治疗急慢性病毒性肝炎，疗效确切。本研究主要观察甘草酸二铵的保肝作用是否与其抗肝细胞凋亡因素有关。研究结果表明，甘草酸二铵能够在一定程度上抑制LPS所致HepG2细胞凋亡，提示抑制细胞凋亡可能是其保护肝细胞的机制之一。在此实验基础上，进一步研究甘草酸二铵对细胞凋亡的调控机理，具有理论和临床实践意义。
4.参考文献
[1]姚云清, 张定凤, 罗云, 等. 内毒素诱导原代肝细胞表达FasL及其细胞毒效应. 中华肝脏病杂志, 2000, 5: 285-287.
[2]Choi KB, Wong F, Harlan JM, et al. Lipopolysaccharide mediates endothelial apoptosis by a FADD-dependent pathway. J Biol Chem, 1998, 273: 20185-20188.
[3]张大志, 张定凤, 任红, 等. 重组人生长激素对内毒素致肝细胞凋亡效应的抑制作用. 中华肝脏病杂志, 2001, 2: 100-102.
作者单位：400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所（郭晖，黄爱龙，唐霓，张定凤）；重庆医科大学附属第一医院（姚云清）
|
