进展期肝功能衰竭(advanced acute liver failure)唯一证明有效的治疗措施是急诊肝移植(liver t rans2plantation , L T) [1] 。然而,许多患者却由于供肝的严重缺乏而在等待中死去。这促使了研究者对肝功能支持研究的兴趣。理想的肝功能支持可以使患者成功的桥接(bridge) 肝移植或者使患肝得以再生恢复[2 ] 。作为一种替代疗法,一个桥接设备可以像肾透析一样为衰竭的肝脏提供长期的支持[3] 。在生物人工肝中(bioartificial liver , BAL) ,患者的血浆循环通过体外的生物反应器,该反应器装载有具有生物合成、解毒和生物转化功能的肝细胞,从而发挥肝功能支持作用。人原代肝细胞可以提供大部分肝功能,因此是生物人工肝中最理想的肝细胞来源。本文主要对 人肝细胞的分离技术、培养方法及冻存研究进展作一综述。
1. 人肝细胞的分离
人肝细胞主要来源于外科切除标本及由于严重脂肪变性或者肝硬化而遗弃的供肝[48 ,22 ,24 ] 。与脂肪肝相比,肝硬化肝分离的肝细胞产量及活性均低,但肝细胞的安定代谢功能却没有差别8 ] 。
目前广泛应用的人肝细胞分离技术是Seglen[9]创立的胶原酶两步法灌注分离技术。简述如下:于整肝灌注,通过门静脉插管并固定;而对于肝段,则通过切面主要血管开口插管,其他血管结扎以防漏液。首先用含离子鳌合剂如EDTA[7 ,8 ,24 ] 或者EGTA[23 ,25 ]的无Ca2 + 缓冲液(保持37 ℃) 灌注,目的是去除Ca2 + 离子,打破细胞间桥粒紧密连接。接着用含Ca2 + 离子的胶原酶缓冲液灌注消化组织。收集消化后的肝细胞并悬浮于冰冷的培养基中。然后,通过不锈钢筛网过滤及低速离心纯化肝细胞。分离纯化后的肝细胞通常立即采用台盼兰抗拒染色法评估细胞活性[7 ,8 ,23～25 ] 。许多研究小组通过对该技术略加改良分离获得肝细胞[4～7 ,24 ] 。最近,一个意大利研究小组设计了一种改良四步法来分离人肝细胞,目的是减小缺血再灌注损伤及提高细胞分离后能量状态,从而提高分离后肝细胞的活性[6 ] 。与传统两步法相比,其在EDTA 灌注前及胶原酶灌注后采用含甘氨酸、丙氨酸及果糖等基质的灌注液灌注,以促进肝细胞分离后的能量恢复[6 ] 。分离肝细胞的数量及活性主要取决于组织质量、供肝冷缺血时间、灌注液成分、胶原酶类型和浓度。大多数研究中所用的酶为胶原酶Ⅳ或胶原酶P[7 ,8 ,24 ,25 ] 。Liberase 是一种用来分离胰岛细胞的酶,它具有更低细菌污染的优点,最近有报道用来分离肝细胞Donini 等[10 ]曾比较Liberase HI 与胶原酶P分离猪肝细胞的效果,结果发现Liberase HI 可有效的分离获得更高活性的猪肝细胞。因此,许多小组应根据自己实验室条件建立自己的分离技术,这主要考虑下述因素:理想的灌注装置、胶原酶类型及浓度、灌注液离子浓度、灌注时间及温度、灌注液流速等。
2. 人肝细胞原代培养
成熟肝细胞通常不能存活超过2 周,并且在标准体外培养条件下不能增值。长期培养肝细胞,首先需要良好的细胞贴壁。这就需要培养器皿必须被覆某种基质如胶原酶Ⅰ或明胶[5 ,11 ,12 ]以提供细胞生长所需要的相似的体内细胞外环境。另外,培养基中须添加人类血清[4 ] 、生长因子如HGF 和/ 或EGF[5 ,13 ] 、胰岛素[11 ,14 ] 、糖皮质激素如地塞米松[15 ]等。最近,Katsura 等[4 ]发展了一种培养体系,能够长期培养人肝细胞并能保持肝细胞的分化功能。他们发现人肝细胞在添加了10 %人血清、10 mmol/ L烟酰胺、10 ng/ mL EGF、0. 5 μg/ mL 胰岛素、10 - 7mol/ L 地塞米松及抗生素的角蛋白刺激因子培养基(keratinocyte2stimulating factor medium) 中可以存活超过56 天。尽管许多研究者建立了各自的人肝细胞长期培养方法,但这些研究多为所需肝细胞数量较少的药理学方面的研究,其培养的细胞量并不能满足生物人工肝的需要。对于生物人工肝而言,通常需要超过1010 个细胞以维持患者肝功能[2 ] 。因此,生物人工肝需要特殊的肝细胞培养体系,其不仅能提供足够的表面积以供大规模肝细胞贴壁,而且能提供细胞生存所需的足够的营养及氧气。
3. 人肝细胞的冻存
肝细胞的获得是不确定的,而且一旦获得,将会分离出大量的肝细胞(超过109 个肝细胞) ,通常超过了研究所需。这样,许多肝细胞将被浪费掉。虽然肝细胞可以短期保存在UW 液中[23 ] ,但是仍需要发展长期保存肝细胞的冻存方法,以期获得在研究及临床中最大限度的应用。在过去的20 年中,许多关于猪肝细胞[15 ,16 ]和人肝细胞[14 ,19]的冻存方法已经被提出。但目前尚没有一个标准的冻存方法。任何冻存方法的最终目的是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成,从而保持解冻后细胞活性、粘附能力及代谢活性。一个成功的冻存方法主要取决于冻存速度、冻存肝细胞的浓度、冻存保护剂的类型及终浓度等[17] 。许多研究应用计算机程序冷冻仪来控制温度,使其以更精确的方式下降,从而避免悬液中细胞内冰晶的形成。Guillouzo [18 ]回顾了1999 年研究文献,结论是没有可信的证据表明复杂的程序降温比普通的- 20℃然后- 80 ℃两步降温法更有利。近,Alexandre 等[19 ] 比较了计算机控制型冷冻仪实现的阶梯式降温法( stepwisef reezing, SF) 及异丙醇冷冻仪实现的逐步降温法(progressive f reezing , PF) , 发现总复苏率PF(38 % ±3 %) 高于SF ( 12 % ±2 %) 。二甲基亚砜(dimethylsulfoxide , DMSO) 在多数研究中用来作为冻存保护剂[14 ,19 ] 。聚维酮(polyvinylpyrrolidone) 是另外一种冻存剂,它可以保护细胞的亚结构[19 ] 。至于肝细胞在液氮中冻存时间问题,目前认为冻存时间对解冻后肝细胞功能影响很[20 ] 。
总之,理想的肝细胞冻存方法还没有出现,仍需进一步研究。最近,一个意大利研究小组报道了第一例应用冻存肝细胞的生物人工肝成功桥接一名暴发性肝功能衰竭患者到肝移植[21 ] 。虽然目前尚无标准冻存方法, 而且肝细胞在解冻后有60 %～ 65 %的丢失[19 ] ,但无疑冻存肝细胞在生物人工肝未来的应用中有着广阔的前景。
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