生物人工肝( bioartificial liver , BAL) 是以培养肝细胞为生物材料、具有体外代偿肝脏功能的人工器官装置。从生物学角度看, 用于BAL 的理想肝细胞应具备以下特征: ①人源性; ②具有肝细胞的正常表型; ③容易获得; ④易于培养且能迅速生长至高密度; ⑤能保持良好分化状态数天至数周; ⑥具有成熟肝细胞特征的所有代谢功能。但是到目前为止,还尚未有任何一种肝细胞能达到如此完美的程度,故生物型人工肝细胞的来源及相关研究成为该研究领域的热点问题,本文就其研究进展进行综述。
1 同种肝细胞
具有成熟肝细胞特征的人类肝细胞是最理想的细胞。但来源受限,外科手术切除标本大多有不同程度的病变,且正常细胞少、活性差,肝细胞获得率低。此外,应用此类细胞还存在潜在的癌肿转移、病毒、细菌感染等问题。胎肝细胞是较好的细胞来源,尤其是较大月龄者分离出的肝细胞,免疫源性弱,组织分化功能强,很少引起异种蛋白反应。研究者们已对胎肝细胞用于BAL的可能性和前景进行了研究和探讨,证实实验分离获得肝细胞平均数为318×107,且新分离肝细胞的活力相差很大,平均61%。采用生化分析仪可检测到培养上清液中由胎肝细胞合成分泌的白蛋白(ALB)及甲胎蛋白(AFP)。光镜和电镜观察均可见培养肝细胞的正常形态和结构,将培养的肝细胞孵育于中空纤维反应器内时,胎肝细胞存活1周以上[1]。在经历大量动物细胞、细胞株作为生物材料的研究之后,该研究重新引起研究者对胎肝细胞用于BAL可能性和前景的关注。但其来源也受到一定限制且涉及伦理问题,因此难以广泛推广应用。
2 异种肝细胞
迄今,用于人工肝的动物有鼠、兔、犬、猪及灵长目动物。其中灵长目动物与人类最为接近,为首选的细胞材料,然而此类研究甚少,可能与诸多限制如伦理、微生物、安全性及动物资源紧张有关。Donato 等测定了其余四种动物肝细胞及人肝癌细胞株的代谢功能,并与人正常肝细胞进行了比较,结果显示猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近,优于其他细胞,而人肝癌细胞株的代谢能力极为有限,表明猪肝细胞是一种良好的细胞材料,以其来源丰富,价格低廉应更适于人类应用[2 ] 。使用猪源性人工肝支持系统主要的缺陷为: ①受体抗猪细胞的免疫反应; ②有限代替人肝脏的生理能力; ③有促发人畜共患疾病的潜在可能。猪肝细胞用于BAL 首先需要考虑的问题就是异种组织的免疫排斥反应及异种蛋白和酶进入血循环所致的不良反应。但多年临床应用尚未发现有严重免疫反应及不良反应的发生,推测可能与肝衰竭机体免疫功能低下及反应装置中使用生物半透膜有关,此外可能与使用持续时间短,重复次数少,不足以刺激机体产生抗体有关。猪肝细胞虽然易含有内源性逆转录病毒( PERV) ,但到目前为止, 还未发现接受治疗患者感染PERV 的证据,但对其长期安全性尚不清楚,因此,在生物反应器组成的BAL 系统中安装半透膜,采取有效的免疫隔离措施以提供保护屏障很有必要。一方面可阻止抗体进入引起的免疫损伤造成广泛的猪肝细胞坏死以及细胞坏死释放的炎性物质反流入人体内;另一方面也可阻止异种组织中的抗原物质进入血液循环。有研究者报道采用150 mm 半透膜可使病毒感染的可能性降低10万倍[3] 。
3 肝细胞株
3.1 肝肿瘤细胞株
无论是动物还是人原代离体肝细胞,均存在体外培养要求高,存活时间短,增殖及传代困难等缺点,加上正常人肝细胞来源有限,故研究者们又开始寻找并采用肿瘤细胞株以弥补上述不足。已建立的肝肿瘤细胞株在实验研究中大多取得了较满意的疗效,但出于安全性考虑,目前肿瘤肝细胞株主要用于BAL 的实验研究,仅C3A 作为细胞成分已用于人工肝临床治疗研究,迄今已建立的肿瘤细胞株尚不具备完全的成熟肝细胞的功能,而且还存在着潜在的肿瘤特性和遗传、代谢及合成功能的改变,显然用现有的肝肿瘤细胞株来代替人类全部的肝功能还存在着目前无法解决的问题。
HepG2 是一株建立较早的肝癌细胞株,从肝母细胞瘤分离而来,具有某些类似于正常肝细胞的代谢解毒功能,已作为肝细胞的替代物用于BAL 的实验,但细胞的分化功能和分化程度均较低。3A 细胞株系从HepG2 衍化而来,但分化程度高于HepG2 细胞株,且具有良好的分泌ALB、参与尿素及糖原合成等肝细胞特异性功能,有很强的增殖能力。然而,Nagaki等将人肝癌细胞株HepG2 、HuH27 、PLC/ PRF/ 5和鼠原代肝细胞分别培养于含0.2 mMNH4CL 的MEM 培养基上,结果只有原代鼠肝细胞可以快速且较完全地降低培养液中的氨浓度,其他三种肝细胞株氨水平持续升高,说明作为BAL 的细胞源,人肝癌细胞株要逊于原代肝细胞[4]。同样Wang 等将猪肝细胞与C3A 细胞进行了比较,结果显示C3A 细胞株的活性、氨清除以及氨基酸代谢能力均相对较低[5]。由于BAL 所用细胞材料的代谢转化功能较生物合成功能更为重要,尤其在治疗肝衰竭的肝性脑病中,去除血氨是BAL 的重要功能之一,故作为BAL 的细胞材料增强肝细胞株的代谢能力实属必要。为此,有研究者[6 ]采用特殊方法设计具有特定肝功能的肝细胞株,如将肝特功能等, 取得了令人满意的结果。另一学者Khalil等将HepG2 细胞包裹于海藻酸盐珠内形成内聚球形集落,并与其单层培养进行了比较,结果显示用海藻酸微囊培养的HepG2细胞的肝特异性功能明显上调。
3.2 回复肝细胞(reverted hepatocytes)
近几年来,国外学者设计了一种可回复性永生化程序(reversible immortalization) ,为解决细胞材料问题提供了新的思路和手段。其基本原理是将永生化SV40T 肿瘤抗原基因导入原代细胞以获得永生化细胞株,然后再以特异性位点重组技术切除SV40T 基因,使细胞株回复到永生化前的原代细胞状态,这样获得的细胞既能无限增殖,又不具有致癌性及病毒感染的可能性。日本学者Kobayashi 将含有SV40T基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶的复制缺陷腺病毒载体SSR # 69 导入正常原代成人肝细胞,获得的永生化N KNT23 细胞株具有肝实质细胞的形态学特征,可表达SV40T ,有很强的增殖能力。经表达Cre 重组酶的SSR # 69 转导后, 以LoxP 重组位点为两翼的SV40T 基因被切除,N KNT23 不再表达SV40T ,分化程度更高,核浆比胞浆颗粒类似原代肝细胞。动物试验将回复前后两种肝细胞植入大鼠肝脏, 次日行90 %肝切除,结果两组存活率分别为45 %和60 % ,而未行肝细胞移植组全部死亡。两组均见肝脏形态和功能的显著改善,残余肝叶增大并示明显肝再生,脾脏“肝化”,以回复肝细胞组显著[7] 。可回复永生化肝细胞具有良好的肝细胞功能,无致瘤及引起病毒感染的危险,优于肿瘤细胞株,可在体外人工肝支持系统中发挥特异性肝代偿作用,在今后BAL 中有着良好应用前景。
3.3 病毒转染的肝细胞株
OUMS229 是人胎肝细胞被转染含有编码SV40T 肿瘤抗原的PSV3neo 质粒而获得的永生化肝细胞株,能够表达多种特殊肝脏的基因。将OUMS229 细胞移入90 %肝切除鼠的脾脏,一周内存活率60 % ,而未移植细胞的对照组肝切除鼠2d 内全部死亡。提示OUMS229 可明显降低血氨水平,改善肝性脑病,能够为肝衰竭动物提供代谢支持作用,提高短期存活率。同时将OUMS229 细胞株移植入裸鼠并未显示恶性肿瘤特征,相比之下,HepG2 细胞在两周内引起裸鼠肝脾多发性肿瘤,提示OUMS229 的恶性程度较低,用于BAL 治疗将大有裨益[8] 。原代猪肝细胞与人的代谢能力相似,但其体外培养时存活时间短,易丧失代谢功能,其应用也受到一定的限制。由原代猪肝细胞转入SV40T 基因而成的Hepliu 永生化猪肝细胞株可无限传代,且高度分化,仍能表达原代猪肝细胞的特征标志物细胞角质蛋白( cytokeratin ,CK) 18 ,ALB 合成能力保持完好,并具有较好的细胞色素P450 代谢活性,无致瘤性,可作为BAL 中的有价值的细胞材料。
3.4 人正常肝细胞株
人们曾经通过建立不含原癌基因或癌基因的永生细胞株来解决肝细胞来源问题。研究者从正常肝组织中分离肝细胞,经胶原凝胶夹心系统强化培养获得的HHY41 细胞株持续培养1 年余仍保持稳定的活性,具有典型的肝细胞形态特征,能表达肝特异性抗原并能分泌ALB等多种肝特异性蛋白, G262P 酶和细胞色素P450 活性良好。通过该技术建立的细胞株于体外培养时虽具有快速增殖能力,但是这种永生化的细胞株没有显示出长期的活性和肝细胞的特异功能,ALB 的分泌也消失得比较快,且有高度的癌变倾向。来源于正常肝脏,通过与鼠内皮细胞共同培养而永生的其它人细胞株,如HH01 、HH02 、HH09 和HH25 ,连续培养5年仍保持活性,并表达一系列的分化功能,但将这些细胞株分泌白蛋白的能力与新鲜分离的原代肝细胞相比,只有后两种细胞株在胆红素结合方面与之有可比性,而在P450 活性,碳水化合物代谢及尿素合成方面均无可比性。
4 肝干细胞
肝干细胞有肝源性和非肝源性两类。前者包括胆管源性卵圆细胞和分化肝细胞,后者包括胚胎干细胞( ESC) 、骨髓/ 血液干细胞及胰腺上皮祖细胞等。肝干细胞与肝坏死后的再生与增生有关。目前认为,肝再生通常通过处于增生静止期的分化肝细胞进入细胞周期完成。正常成年肝脏是一个相对静止的器官。如果肝脏受损严重以至于肝细胞大部分被毁损或由于某些原因,如致癌物质或肝毒性药物,阻止或延迟肝细胞进入增生循环,则肝干细胞被激活产生所谓的卵圆细胞,并进一步分化为肝细胞和胆管细胞。卵圆细胞是一种体积较小,细胞核呈卵圆形,外周包绕少量嗜碱性细胞浆,核/ 浆比例较高,细胞器欠发达的一类细胞。卵圆细胞为多向干细胞,可向肝细胞、胆管上皮细胞及免疫细胞发展。尽管迄今有关肝干细胞的研究仍主要集中在基础研究方面,但其潜在价值无疑是十分巨大的。新近Xiao 等[9 ]对35个肝纤维化标本研究, 在电镜下证实其小上皮细（small epithelial cells , SEC) 与卵圆细胞极为相似,均能表达ALB 及CK7 ,并显示了向胆管上皮及肝细胞分化的趋势,提示存在两类肝干细胞,即胆管源性卵圆细胞和分化肝细胞。另一学者Hamazaki 等[10 ]成功地在体外将小鼠ESC定向分化为成熟肝细胞。新近Cantz 等[11 ] 将从鼠胎儿肝脏中分离出来的增强绿色荧光蛋白转基因ESC 植入肝再生鼠模型中,使用二肽二酰酶IV、AFP 及ALB 基因表达作为鉴定指标,有力地证明了体外ESC 向肝细胞分化的过程。Lagasse 等[12 ]对9 例雌性FAH2/ 2/ 129SvJ 小鼠实施致死性射线,继之静脉输入雄性ROS26/129SvJ 小鼠的骨髓细胞,结果4 例得以存活,肝组织见50～200个015～4 mm 增生肝细胞结节,经证实为外源性即Y 染色体阳性肝细胞;作者又进一步从骨髓细胞中纯化出血源性干细胞, 其标志物为c2kit high Thylow LinSca21 +(缩写为KTLS) 。仅50～100个KTLS 细胞即可见肝再生结节。尽管迄今的研究结果[13 ]表明,这种转化细胞增殖作用有限,尚不具备实际应用价值,但仍提供了一条重建肝细胞功能的重要思路。
5 肝脏非实质细胞
已有大量证据表明,肝脏非实质细胞(non2parenchymal cells ,NPCs) 在维持肝细胞正常功能及表型状态中发挥重要作用。在体内,肝细胞表现有非凡的增生能力。然而,体外培养的原代肝细胞行为却迥然不同:肝细胞不易在体外培养生长。在普通条件下,12～24 h 即丧失其间隙连接结构,3～5 d 细胞呈扁平状,失去其特异组织结构,1～2 周全部死亡。对这种现象的解释是肝细胞严格依赖肝脏的三维结构、血流模式和与NPCs 相互作用以获得其分化功能和独特的存活状态[14 ] 。鉴NPCs 也是肝细胞的重要成分,与肝细胞的分化、代谢活性及再生能力等密切相关,近年来,其在BAL 中的潜在价值已逐渐引起注意。细胞外基质(ext ra2cellular mat rix , ECM) 在肝细胞生长和分化中起着重要作用,培养于ECM 上的肝细胞其特异性功能可保存较长时间。将肝实质细胞与NPCs 共培养,可较好模拟体内的生长状况。为了保证肝细胞生长状况良好,保持肝细胞的分化增生能力。协调肝实质细胞与NPCs 及肝细胞ECM 的关系至关重要。研究证实[15 ]NPCs 中的肝上皮细胞和星形细胞可产生Ⅳ型胶原和层粘连蛋白,当与肝细胞共培养时,以星形细胞为主的NPCs 可被激活而产生各种ECM。在Michalopoulos 等的旋转瓶培养的动态环境中,肝细胞保持极大的表型稳定性,作者认为这种稳定性即依赖于由NPCs 合成的ECM , Ⅳ型胶原直接包绕肝细胞,形成克隆或Ⅰ、Ⅲ型胶原为肝细胞生长提供结构支持,形成许多器官特异性结构,如胆小管、肝板及肝板与窦间隙间的类似Disse 间隙的结构。Mitaka 等将分离的大鼠肝细胞、小肝细胞与NPCs 共培养,结果证实不成熟的小肝细胞能够分化为成熟的肝细胞,肝细胞特异性功能得以加强,同时观察到NPCs 可诱导胆管样/ 囊样结构产生,这可能对维持三维结构的生存环境,改善肝细胞的代谢活性和存活起重要作用。在这种培养条件下,肝细胞存活达3个月,并保持高分化状态。
总之,目前BAL 在肝衰竭的临床治疗中已占有重要地位,作为BAL 核心部分的细胞材料也取得了很大进展。肝细胞种类的选择、传代、长期培养、功能维持、保存及人源肝细胞的严重短缺等问题有待解决。迄今为止,国内外从同种肝细胞、异种肝细胞、肝干细胞及通过基因工程永生化细胞株等进行研究探索,取得了良好的效果。由于肝细胞在体外增殖能力很低,在BAL 中存活时间短,容易丧失活性,人们使用基质包被、微载体、微囊等球形聚集培养, 与NPCs 混合培养以延长肝细胞存活时间,增强和保持肝特异性功能的表达,今后的研究方向和重点可能围绕上述问题,进一步发展BAL 理想的细胞材料,利用细胞培养与生物工程技术相结合手段、多种类细胞混合培养或人工构建类似肝小叶三维结构,利用核移植和克隆技术发展个体化的肝干细胞和组织器官,将为BAL用于肝衰竭患者的肝再生提供最大希望。
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