大多数生物 人工肝(bioartificial liver ,BAL) 装置以原代猪肝细胞作为生物成分,然而,由于异种移植相关危险性,猪肝细胞终究不是最佳选择。人肝细胞系无论哪方面都具有比动物肝细胞要好的特性,所以是应用于BAL 的候选细胞。肿瘤来源细胞系C3A 和HepG2 具有多种肝细胞功能,但缺乏一些特异的肝功能,如氨解毒和尿素生成等。永生化肝细胞可能提供更好的BAL 应用前景。另一有希望的方法是应用胚胎或成人干细胞。啮齿动物干细胞已经可在体外定向分化为肝细胞,这些体外诱导方法可能也适用于人干细胞。但是,在人肝细胞系和分化的干细胞成功用于BAL前,其功能和安全性必须得到验证和改善。
在过去的十几年,发展了许多BAL 并验证了其能明显延长急性肝衰竭(acute liver failure ,ALF)实验动物的生命[1～4 ]。这些令人鼓舞的成果引发了其对ALF患者疗效的临床研究热潮。这些BAL在结构上虽然不同,但一般都以原代肝细胞作其生物成分,其对肝细胞的要求是量大,约为15亿,相当于成人肝脏的10%～15% ,安全和有功能。BAL装置的体外功能一般通过监测其血清蛋白、药物代谢酶的表达、氨清除和尿素生成能力来评估,特别是氮代谢活性被认为是BAL的一个重要参数,因为氨的积蓄与肝昏迷密切相关,而肝昏迷又是ALF中引起死亡的主要原因。肝细胞的安全性方面应包括高度无菌和没有可传播的病原。生物反应器应含有切割分子量(Mr)为1×105的半透膜位于BAL装置和患者血液之间,以避免BAL中细胞或细胞碎片进入患者的循环系统及患者的免疫球蛋白等成分进入BAL。
迄今为止,大多数动物和临床BAL 研究都是使用原代猪肝细胞。猪肝细胞可大量获得,能表达与人肝细胞相当甚或更高水平的肝特异功能[5] 。然而,由于人兽共患疾病和免疫学问题,猪肝细胞的临床应用受到严重阻碍。在BAL的临床应用中最理想的还是使用原代人肝细胞。目前,大概有三种BAL装置尝试使用了原代人肝细胞: (1) 柏林的编织多室性毛细管BAL ,其中胆管上皮细胞与肝细胞共培养以保持和增强后者的白蛋白合成功能[6] ; (2) 国内的EBLSS(体外生物人工肝支持系统) ,已成功延长无肝狗的生命[7] ;3)ELAD(体外肝辅助装置) 系统,已用于一次超过100h的临床治疗,其间临床指标得到改善,血氨水平降低20%以上[8 ] 。可是,由于供体肝的短缺,其供给无法满足基于人肝细胞BAL 装置推广的需要。原代肝细胞应用的其它不足之处,一般说来是质量控制受限,供者的异质性,冻存后功能降低以及保持的肝细胞功能有限。因此应用于BAL的人肝细胞系越来越受关注。这些细胞系一般表现出很好的生长特性。由于肝细胞的功能对其培养条件具有极大的依赖性,所以各种细胞系应与原代肝细在相同培养条件下进行比较从而作出充分地评价。
1 肿瘤来源细胞系
最先被分离的具有肝细胞功能的细胞系来自肝母细胞瘤或肝细胞癌(HCC) ,其肝细胞功能总的来说是降低的。而来源于肝癌细胞的HepG2细胞株却具备多种肝细胞功能并因此被认为可应用于BAL。HepG2无细胞色素P450 CYP2C 活性,其尿素合成、葡萄糖苷化、硫酸酰化及氧化代谢等活性约为原代大鼠肝细胞的1/ 10[9]。而HepG2的白蛋白合成率则优于原代大鼠肝细胞。在相同条件下,其尿素合成水平比原代大鼠肝细胞的低[10]。氨浓度的增加可能是谷氨酰胺高分解代谢的结果。这一现象也在人肝癌细胞系Huh7、PLC/ PRF/ 5T和C3A 中观察到。
C3A 细胞系是HepG2 衍生的一个克隆,有很强的接触生长抑制和高表达白蛋白及甲胎蛋白(AFP) 特性。C3A 是唯一培养于ELAD 系统并用于动物实验和临床试验的细胞系。在C3A 细胞基础上的ELAD 治疗ALF 狗实验中,治疗组存活率为80 % ,而非治疗对照组为零[1] 。在新近体外模型研究中,C3A 细胞以藻酸盐微囊化流动培养于生物反应器中,微囊的三维结构为细胞提供了合适的微环境,使得细胞的总蛋白、白蛋白和尿素合成功能得到有效保持。这与普通培养和微囊静态培养对照相比,仅微囊化的C3A 细胞具有氨解毒功能,而且流动培养方式加强了物质的传输和微囊内细胞产物的释放[11 ] 。就蛋白和尿素的合成及释放而言,联合运用微囊化和流动培养技术使C3A 细胞系极有潜力应用于BAL 进行体外肝支持。另一被用于BAL 实验的肝癌细胞系是FLC27。细胞被培养于辐射状流动生物反应器中[12] ,白蛋白合成也很高,AFP 也有合成,但未检测到其它肝细胞功能。
总之,肿瘤源细胞系存在局限性,在BAL 应用中只具有部分肝细胞功能,比如白蛋白合成,但其它功能不足,如氨清除活性。另外,肿瘤细胞迁移的危险性严重阻碍了其在BAL 中的应用。
2 永生化细胞系
通过对肝细胞的永生化,已经建立了一些表达肝功能的细胞系以替代肿瘤来源的细胞系。人类细胞的体外永生化是一个复杂的过程。在此过程中,遗传突变的积累超越控制细胞增殖的正常机制[13] 。原代细胞在培养中倍增次数有限并伴随端粒缩短,直到细胞进入衰老期或M1 期的非分裂状态。M1 可能是由于一条或几条染色体端粒严重缩短,从而产生DNA 损伤信号所致[14 ] 。随后,细胞通过p53 和pRB/ p16 对细胞周期控制机制的诱导,停留在G1 期。少数细胞可以通过病毒癌基因的引入而逃逸M1 期,如猿猴病毒大T抗原(SV40T) ,它具有多向效应,能阻断p53 和pRB 的作用或特异性干扰一个或多个控制细胞周期的基因。逃逸M1 期的细胞将继续分裂,端粒继续缩短,直到危机期或M2 期,端粒严重变短,导致染色体不稳定和重排最终凋亡。通过导入人端粒酶逆转录酶(hTERT) 的表达,可以恢复并维持端粒长度,使细胞避开M2 期[15 ] 。在大多数正常细胞中是检测不到hTERT 活性的,其只存在于干细胞和80%～90%的癌细胞和永生化细胞系。在肝内,hTERT 阳性率非常低,并且与HCC 组织去分化程度相关:高分化细胞只有3% ,而低分化HCC 中达95%[16 ,17 ] 。在端粒酶之外,一种所谓替代延长端粒(ALT) 的未知机制在25 %的永生化细胞系中起着维持端粒的重要作用。总之,成功的细胞永生化可通过导入M1 期克服因子和hTERT来完成[18 ] 。
永生化人肝细胞可来源于胎肝或成熟肝组织。与成熟肝细胞比较,胎肝细胞具有较高的体外增殖活性,但尚不能完全表达已分化肝细胞功能。已永生化的人肝细胞系有HepZ[19 ,20] 、NKNT23[21 ,22 ]等,具有一定的肝功能。SV40T介导的永生化一般说来常伴有去分化和核型的不稳定,有时还有致瘤性,而hTERT 永生化细胞保持更多的已分化功能和更少的染色体损伤 [23]。
表1[24]中所列永生化人肝细胞系在致瘤性和肝功能方面特征各有不同。有些细胞系能在软琼脂中生长,表明具有转化特性。但所有测试细胞系在免疫缺陷小鼠体内都未产生肿瘤。它们共有的特征是白蛋白合成功能,也是通常表达的肝细胞功能。然而,与BAL 功能关系密切的其它指标如氨清除,尿素生成或生物转化功能等却研究甚少。一些细胞色素P450 家族成员可诱导表达,而其它成员则可能是下调的。目前,永生化人肝细胞系HepZ 已被用于BAL 试验[19 ,20] 。细胞粘附在大孔性凝胶微载体上,培养于充气的2L容量的生物反应器中。氨清除活性未能测及;相反,微载体产生高浓度的氨。经诱导HepZ 细胞高表达CYP4503A4 ,其表达量4 倍于原代猪肝细胞。总之,在选择候选细胞系作为BAL装置的生物成分之前,有更多的参数须检测。
3 条件永生化细胞系
肝细胞的条件永生化是个新趋势,非常有希望应用于BAL 。在获得足够用的细胞材料时其永生基因可被关闭;永生化回复后,抑制细胞增殖,刺激分化,进一步减小细胞转化的危险性。条件永生化首先应用的是温度敏感SV40T(tsSV40T) ,它在33℃是有功能的,但在39℃失去活性。其次,用可诱导性启动子在转录水平控制永生化因子也成功实现了条件永生化[25] 。最后,使用Cre2lox 系统在DNA 水平控制永生基因也已获得成功[26 ] 。在Cre2lox 系统中,永生基因被置于两个34bp 的loxP 位点之间,而loxP 是P1 噬菌体Cre重组酶的识别位点,Cre 重组酶可介导loxP 位点之间的重组,并从基因组删除loxP位点之间的DNA。这三种条件永生化策略存在一个值得考虑的问题是———永生化回复后细胞内残留永生因子。残留的永生因子是否抑制回复后的细胞分化,是否存在导致肿瘤发生和细胞转化危险性,这些均有待验证。
迄今为止,已获得了四种条件永生化人肝细胞株:tsSV40T永生化的C11和D21 ,SV40T和Cre2lox 系统永生化的NKNT23[26]以及hTERT 联合Cre2lox 系统永生化的TTNT - 1[24] 。在这四种细胞系的报道中,NKNT - 3 被描述得最详细彻底。永生化的NKNT23 在腺病毒载体携带的Cre 重组酶介导回复后,肝特异基因的表达显著增加。将回复的NKNT23 细胞移植给ALF 大鼠后,其存活率显著提高,肝特异指标明显改善。但移植未回复的NKNT- 3 细胞也增加了ALF 大鼠存活率和改善其肝功能,因此回复前、后的肝细胞在体内和体外的功能差异尚不清楚。要评价NKNT23 细胞的实际肝功能,还需与原代肝细胞作比较。Cre2lox 系统的漏洞在NKNT23 细胞中得到巧妙的弥补。通过在永生化载体中合并运用新霉素耐药基因,使其只在Cre2lox 重组发生后激活。经新霉素耐药筛选,即可获得不再表达SV40T 基因的细胞。近来NKNT23 细胞还被培养于BAL 装置中,粘附在GRGDS 五肽纤维素微球体上,搅拌悬浮培养[27] 。这样培养的NKNT23 细胞具有很低的氨清除功能,而HepG2 细胞却不能。
4 干细胞
另一有希望的人肝细胞来源,是具有极大生长潜能的干细胞[28 ] 。能向肝细胞定向分化的人干细胞已经从骨髓和胚胎中分离获得[29 ,30 ] 。卵圆细胞已在啮齿动物成体肝中发现 [31，32],推测人肝脏中也可能存在成体干细胞。在干细胞应用于BAL 前需要解决两个问题:干细胞的去分化增殖和肝定向完全分化。最近有两个小组的研究显示小鼠和大鼠的肝干细胞可持续培养而不失去其分化为肝细胞的能力[33 ,34 ] 。另外,人胚胎干细胞可在小鼠胚胎饲养细胞上以未分化状态无限增殖。最近此培养方法经改良,通过运用细胞外基质和成纤维细胞条件培养基,实现了多种胚胎干细胞的无饲养细胞的培养,这开辟了在BAL 装置中培养胚胎干细胞的道路[35 ] 。肝细胞分化在体内相对容易诱导,因为体内可溶性信号分子和细胞外基质的协作效应是最佳的。例如,造血干细胞在体内能分化为肝细胞:给酪氨酸血症的小鼠血管内注射成体骨髓细胞,结果小鼠获救并恢复肝脏的生化功能[36] 。
人干细胞在体内向肝细胞分化的条件应该与上述体内条件相似。生长因子对胚胎干细胞的效应研究显示,肝细胞生长因子(HGF) 和β2神经生长因子(NGF) 可诱导其向白蛋白表达细胞分化,但未获得纯系培养[30 ] 。肝细胞分化的其它启示归功于对啮齿动物干细胞的研究。在肝细胞培养液和胆汁的体液信号刺激下,大鼠骨髓干细胞可向肝细胞分化[37] 。分化效率是很高的,因为加入氨后,分化细胞产生的尿素达原代肝细胞产生的63 %。此外,大鼠成体肝干细胞在去分化培养时撤去成纤维细胞饲养层后可自发分化[34] 。要限定有效诱导干细胞向肝细胞分化的因子,还必须进行深入研究,但干细胞在BAL 中应用的前景是光明的。
5 优化和安全性
目前的人肝细胞系还不是很理想,也许具有不同专门功能的各种细胞系可以联合运用于BAL 。为获得BAL 中细胞系的最优功能和安全性,还需考虑一些因素。
这些细胞系的功能可通过在现有细胞系中引入肝转录因子或肝细胞功能的关键基因而进一步优化。导入并稳定表达谷氨酰胺合成酶基因的HepG2 细胞系能显著增强氨清除活性,其活性水平是原代肝细胞的1/ 7[38] ;而单独HepG2 细胞是检测不到此功能的。原代肝细胞与肝非实质细胞共培养可以改善和保持肝细胞的分化功能,这对肝细胞系可能也是有效的。有几种非实质人肝细胞系就已建立起来了[39 ,40 ] 。原代人肝细胞与人肝星形细胞系LI90 共培养可显著提高CYP450 活性,但对尿素合成功能没有影响。非实质细胞通过旁分泌加强肝细胞的功能和分化,保持肝细胞的双极性。球形体和微囊化培养[11 ]对肝细胞的分化状态有相似的积极效应。使用如丁酸盐、DMSO 和无血清培养液等促分化剂也可能优化细胞系的功能。
在BAL 中使用细胞系必须严格控制。肿瘤源细胞有可能进入患者血液循环,尽管患者的免疫系统可能立即清除这些逃逸的细胞及其成分,这仍是最现实的危险。在细胞系中合并导入自杀基因然后给患者服以“前药”(即药物前体如GCV被TK基因产物作用为有毒物质,导致细胞死亡)使可能进入患者体内的细胞自杀清除,采取这样的安全手段可以减少逃逸细胞种植成瘤的危险。
例如,OUMS229 细胞中导入了单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK) 其功能与原细胞系一[41] ,但给患者服用更昔洛韦(GCV) 可使进入患者血循环的细胞选择性自杀死亡。
总之,细胞永生化、干细胞、肝细胞分化和细胞控制方面的研究进展为BAL 装置的细胞应用提供了新的前景。特别有希望的细胞可能是hTERT永生化细胞,条件永生化细胞和可在体外分化为肝细胞的干细胞。然而, 在考虑应用于BAL 之前,这些细胞的功能及生长特性必须彻底研究清楚。
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