甘草酸18H差向异构体对慢性肝损伤小鼠花生四烯酸代谢的影响

 

茹仁萍，吴锡铭，方红英

（浙江省杭州市第六人民医院药理室，浙江杭州310014）

中国分类号：R965：R975⁺.5 文献标识码：A文章编号：1006-4931（2001） 09-0029-01

摘要 目的： 研究甘草酸对慢性肝损伤小鼠肝组织花生四烯酸代谢的影响。方法：应用CaIN-FCA建立小鼠慢性肝炎模型，并使用两种甘草酸18H差向异构体进行治疗，实验结束后用RIA-HPLC法测定小鼠肝组织AA代谢物。结果：两种甘草酸差向异构体治疗组均能降低肝组织中TXA₂、LTB₄水平与升高6-Keto-PGF值的作用。结论：两种甘草酸差向异构体可能通过抑制花生四烯酸的代谢发挥抗慢性肝损害作用，而18α-GA优于18β‐GA。

天然甘草酸（18β-Glycyrrhizic acid ,β-GA）能影响花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）的代谢，后者与肝脏炎症病变有密切关系（1-2）。关于β-GA的差向异构体α-GA对AA代谢的影响，尚未见文献报道。笔者采用荧光标记反相高效液相色谱法（HPLC）和放射免疫法（RIA）测定慢性肝炎肝组织中的AA代谢物，并比较研究甘草酸两种差向异构体抗慢性肝损伤的作用。

1.1动物 小鼠C₅₇BL/6J，体重（20±2）g，雌雄兼用，中国科学院上海实验动物中心提供，实验间自由进食和饮水。

1.2品 卡介苗(BCG Vaccine)购自上海生物制品所,3*10⁹ml个活菌(相当80g/I,4ºC保存)；关乳糖胺（本室自制，sigma标准）；二缩甘露醇单酯，Leukotriene B₄(LTB₄),Leukotriene C₄(LTC₄)(98%),前列腺素E₂（99%），2苯-18-冠醚-6，4-溴甲基-7-乙氧香豆素（Br-Mac）均为sigma公司产品；6-酮-前列腺素F_1a,血栓素A₂放免药盒为中国医学科学院药理室提供：18β-甘草酸铵（18β- GA，>98%），18α-甘草酸铵（18α- GA，>98%）为本室自制，实验前用磷酸盐缓冲液（pH6.8）制成灭菌溶液，其他试药皆为分析纯。

2.1肝炎模型的建立^（3）将半乳糖胺（GaIN）用灭菌生理盐水制成中性溶液（0.15mol/L），福氏全佐剂（FCA），取液状石蜡8.5ml，加二缩甘露醇单油酸酯1.5ml，搅拌均匀后分装小瓶，高压灭菌，临用前加入BCC（5mg/10ml）充分乳化。小鼠每组30只，分别腹腔注射GaINI500mg/kg，同时肢体皮下注射0.1ml FCA(5ml/g)，对照组腹腔注射0.4ml生理盐水，每周1次，连续13周后处死，取肝脏，迅速浸入干冰-丙酮浴（-70ºC）中速冻，称取冻下组织1g，加含有5U/ml肝素的生理盐水5ml，制成匀浆，离心（15000转/min,0ºC,30min），取上清液3ml置液氨（-80ºC）瓶中保存，待测AA代谢物。

2.2甘草酸18H差向异构体的作用^[4]治疗组小鼠分为四组，每组30只，同模型组方法中毒，同时按下列剂量给药，18β- GA300mg/kg，18β- GA100mg/kg，18β- GA300mg/kg，18β- GA100mg/kg，每日1次，连续13周后处死小鼠，处理同模型组。

2.3 TXA₂与PGI₂测定 取待测样品用盐酸溶液（1mol/L）酸化至PH值为3，离心（3000转/min,5min）后将上清液倾入注射器内，用反相小柱（ODS，C₁₈）处理后，按文献方法在液闪计数器中测定放射性（Cpm），以Rodbard方法^[5，6]作直线转换后的剂量一反应函数关系计算样本含量。

2.4 LTB₄、LTC₄测定  将待测样品按照TXA₂和PGI₂的方法处理，C₁₈小柱用甲酸甲酯洗脱，氮气流除去甲酸甲酯，残物加Br-Mac无水丙酮溶液（1mg/1ml）和二苯-18-冠醚-6丙酮溶液（40nmol/50ul）TK50ul,再加C17酸和1nmol为内标碳酸氢钾和无水硫酸钠等量混合的细粉2-3mg，密封后于50ºC水浴中反应30min，氮气吹干，残物中加50ul无水丙酮溶解，取20ul，照文献法^[7]进行RP-HPLC分析，并根据标准曲线计算LTB₄和LTC₄含量。

2.5统计学方法 实验结果求均数与标准差，显著性检验用t检验

血浆TXA₂、PGI₂、LTB₄、LTC₄回收率分别为72.5%、81.6%、92.8%、91.3%(n=5)。甘草酸两种差向异构体对慢性肝损伤小鼠肝脏的LTB₄、LTC₄和TXA₂水平有显著抑制作用，对PGI₂则有明显提高作用，但18β-GL低剂量组作用不明显。结果见表1。

 表1甘草酸两种差向异构体对慢性肝损伤小鼠肝脏的LTB₄  LTC₄和TXA₂  PCI₂的影响（n=30）

正常组           828±146      297±55    80±28      76±38

对照组           471±88       840±133   396±91     280±89

18α- GA（100mg）680±180*     433±76**  201±83**   160±80**

18α- GA（300mg）753±158**    351±88**  118±55**   10.3±81**

18β- GA（100mg）671±186*     656±109   299±99     198±92

注：*P<0.05,**P<0.01

已经证明，内源性AA经环氧化酶和脂氧化酶细胞生物转化的代谢产物LTs、PGs及TXA₂与肝脏的炎症免疫损害过程关系密切，是机体分子水平调节炎症反应的一种方式。本实验结果表明，18α、18β-GA对慢性肝损伤小鼠肝组织的PCI₂、TXA₂、LTB₄、LTG₄均有不同程度的影响，其中PGI₂与TXA₂是一对作用相反，相互制约的因子，前者具有稳定细胞膜、阻抑溶酶体释放的作用，TXA₂为PGI₂的生理拮抗剂，它能引起血管内或微血管的血小板聚集，粘附并促进血栓形成，两者均参与细胞免疫调节作用^[8]。GA抑制慢性肝损伤小鼠肝组织中PGI₂与TXA₂的异常水平，提示它可能通过细胞免疫的治疗性调节而发挥作用，有研究证实^[9]，LTC₄、LTB₄是诱发急性肝损害的重要介质，可引起炎症细胞浸润、血管通透性增加、全身微循环障碍等一系列病理改变，GA抑制慢性肝炎损伤小鼠肝组织中LTC₄、LTB₄水平，进一步反映了GA治疗慢性肝炎抗炎免疫作用。在试管研究中，已证明GA能抑制磷脂酶A₂（PL-A₂）活性。因此，GA可能通过抑制PL-A₂活性减少AA代谢物，从而发挥对慢性肝炎的治疗作用。

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